En 1786 el gobierno español, a través de un acuerdo entre el rey español Carlos III y el francés Luis XVI, y oída la recomendación de Lavoisier, contrata a Proust para enseñar química en Madrid. Tras una breve estancia en la capital, se hace cargo de las enseñanzas de química y metalurgia en el Real Colegio de Artillería de Segovia, situado en el Alcázar de la ciudad, donde impartiría hasta 1799 cursos de cuatro meses a razón de tres lecciones semanales. El laboratorio del Real Colegio fue dotado al parecer con los mejores medios de la época y en él Proust, a pesar de los problemas administrativos y burocráticos a los que tuvo que hacer frente, realizó numerosas experiencias sobre composición de sustancias que le llevaron a enunciar la Ley de las proporciones definidas, uno de los principios químicos básicos y que establece que las sustancias se combinan en proporciones constantes y concretas.
La enunciación de la ley, realizada de formas diversas entre 1794 y 1799 le condujo a una disputa pública con otro químico francés Claude Louis Berthollet, quien defendía la variabilidad en la composición de los compuestos en función de su método de síntesis. En 1811 Proust logró que el prestigioso químico sueco Jöns Jacob Berzelius reconociese su enunciado, que sentó las bases para el establecimiento de la teoría atómica de Dalton. Durante su estancia en Segovia Proust dirigió y contribuyó profusamente a la publicación de los Anales del Real Laboratorio de Química de Segovia, cuyos dos tomos completos aparecieron en 1791 y 1795.
Enunció la Ley de las proporciones definidas, uno de los principios químicos básicos, siendo profesor del Real Colegio de Artillería